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大戰綠妖之后，蜘蛛俠帕克（托比?馬奎爾 Tobey Maguire 飾）忍痛拒絕了他唯一的摯愛瑪麗（克爾斯滕?鄧斯特 Kirsten Dunst 飾），因為蜘蛛俠的身份會為自己和親人帶來巨大危險，帕克決定獨立承擔起蜘蛛俠的責任。 帕克一直在忙于應付各種挑戰：學習超能力的靈活運用；在超級英雄與平凡大學生的雙重身份下隱藏自我、小心翼翼地生活等等。帕克對瑪麗越來越難以自拔，但是作為蜘蛛俠又不能對瑪麗展開心扉。 好友哈利因為誤會蜘蛛俠而一直處處與其為作對；唯一的親人嬸嬸也對蜘蛛俠的真實身份產生了懷疑。同時，新的挑戰又出現了：邪惡而強大的章魚博士。帕克在種種壓力下肩負起蜘蛛俠的使命。